C. Bartolacci1, M. Laroche1, H. Gilles1, S. Girard1, T. Robin2, B. Cadier2 et A. Buisson3
1Equipe Lasers, Instrumentation Optique et Applications (LIOA), CIMAP / ENSICAEN, 6 BLVD Maréchal Juin, 14050 Caen cedex,
2 iXFiber, rue Paul Sabatier, 22300 Lannion3 Laboratoire CI-NAPS, Centre CYCERON, Boulevard Becquerel, 14052 Caen cedex
L’imagerie optique du vivant – ou biophotonique – a connu un large développement au cours des quinze dernières années. En particulier, l’apparition de la microscopie confocale et la découverte de nouvelles sondes fluorescentes comme les dérivés de la GFP (Green Fluorescent Protein) ont permis d’accéder à la visualisation en trois dimensions de processus biologiques à l’échelle de la cellule. Cette révolution est aussi la résultante de progrès de la photonique et de la technologie des lasers.
Cependant peu de sources laser puissantes sont commercialement disponibles pour certaines techniques avancées d’imagerie comme la microscopie de fluorescence résolue en temps FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy), puissant outil pour observer la dynamique de processus moléculaires et les interactions protéiques au sein des cellules.. Ces techniques nécessitent en effet des sources laser spécifiques dans le domaine visible et de durée d’impulsions sub-nanoseconde ou picoseconde.
La source laser développée au CIMAP a été étudiée pour exciter efficacement les protéines fluorescentes telles que la CFP « Cyan Fluorescent Proéin » ou la GFP. Son principe repose sur un système hybride comprenant un oscillateur à semi-conducteur et un amplificateur à fibre dopée néodyme. Les impulsions laser sont générées par une diode laser à 930nm déclenchée par le gain et affinée spectralement par rétro-injection. Ces impulsions de faible énergie sont ensuite amplifiées dans une fibre optique double-gaine dopée aux ions Nd3+.
Un effort de recherche important a été mené conjointement avec l’entreprise iXFiber afin de concevoir une fibre optique avec un rendement d’amplification important sur la transition du Nd3+ à trois niveaux d’énergie autour de 930 nm, naturellement beaucoup moins favorable que la transition bien connue autour de 1064 nm. Les processus de pertes par formation d’agrégats d’ions Nd3+ ont cependant été mis en évidence et de nouvelles compositions chimiques du cœur dopé sont en cours d’étude [1].
Les impulsions amplifiées sont ensuite doublées en fréquence dans un cristal périodiquement polarisé de MgO:LN congruent afin de convertir la puissance infrarouge en un faisceau bleu. Cette technologie permet d’atteindre une durée d’impulsion de 90 ps pour un taux de répétition de 43 MHz, compatible avec l’imagerie FLIM rapide. Une puissance moyenne record de 300 mW à 465 nm a ainsi été obtenue dans un faisceau limité par diffraction [2]. Cette longueur d’onde est particulièrement adaptée à l’excitation des fluorophores GFP ou CFP.
La source a récemment été installée au sein de la plate-forme d’imagerie CYCERON (Caen) et des tests préliminaires ont d’ores et déjà validé son fonctionnement sur un microscope confocal fonctionnant en imagerie de fluorescence résolue en temps (techniques FLIM/FRET). La source laser a notamment permis d’exciter efficacement la protéine fluorescente CFP et d’enregistrer simultanément des images en fluorescence et en durée de vie dans de cellules vivantes HEK-293.
Contact : M. Laroche, H. Gilles (IRAMIS-CIMAP/LIOA)
Références :
| •[1] Effects of ions clustering in Nd3+/Al3+-codoped double-clad fiber laser operating near 930 nm, C. Bartolacci, M. Laroche, T. Robin, B. Cadier, S. Girard, and H. Gilles, Applied Physics B 98 (2009) 317-322 |
| •[2] Generation of picosecond blue light pulses at 464 nm by frequency doubling an Nd-doped fiber based Master Oscillator Power Amplifier, C. Bartolacci, M. Laroche, H. Gilles, S. Girard, T. Robin, and B. Cadier, Opt. Express 18 (2010) 5100-5105. |