Abstract:
The development of rapid, sensitive, portable, and cost-effective methods for early diagnosis is now a major challenge for improving healthcare, particularly in emergency medicine and in areas with limited infrastructure. The rapid detection and management of infectious, chronic, and emerging diseases plays a central role in reducing mortality and controlling epidemics. Aware of these needs, in 2006 the World Health Organization (WHO) proposed a set of criteria known by the acronym REASSURED (Real-time connectivity, Ease of specimen collection, Affordable, Sensitive, Specific, User-friendly, Rapid and robust, Equipment-free, Deliverable to end-users), thereby defining the standards that point-of-care (POC) diagnostic tests must meet. To meet these needs, the rise of micro- and nanobiotechnologies in recent decades has paved the way for a new generation of miniaturized analytical platforms. Lab-on-a-chip technologies are a perfect example of this, as they enable functions that were once reserved for centralized and costly laboratories to be integrated into very small devices. These technologies open up new possibilities for accessible, reliable, and field-deployable testing.
In this context, a patented biochip based on giant magnetoresistance (GMR) sensors has been developed to magnetically detect biological targets. This approach is based on the magnetic labeling of biological targets using magnetic nanoparticles functionalized with antibodies specifically directed against the targets of interest. The dynamic detection of these targets, introduced into a microfluidic channel, is performed by GMR sensors, which are arranged face-to-face on either side of the microfluidic channel, allowing simultaneous detection of the labeled biological targets. The first part of this thesis is devoted to a comprehensive and detailed preliminary study of cancer cells (murine NS1 myeloma cells) to evaluate the performance of the GMR biochip as a diagnostic tool. To this end, several criteria such as specificity, sensitivity, reproducibility, and robustness of detection were evaluated in a semi-complex matrix without sample pretreatment. The results obtained were promising, as the specificity and sensitivity of the measurements were demonstrated with an average detection limit of 500 cells/mL.
These results demonstrated the relevance and value of the GMR biochip as a detection tool, leading to a second study focusing on the detection of pathogenic bacteria involved in sepsis. In this second part of the study, work was carried out on different bacterial species (Salmonella, Enterobacter cloacae, and Escherichia coli), which differ from the cells studied previously in terms of their size (ten times smaller) and the antigens expressed on their surface. Numerous preliminary tests were therefore necessary to select the antibodies and magnetic nanoparticles best suited to the study of these new targets. The microfluidics of the biochip were also modified to enable the detection of magnetically labeled bacteria.
The results obtained are encouraging and prove that the detection of pathogenic bacteria is possible, but they also highlight the complexity of selecting new antibodies, the difficulties of labeling associated with the use of new nanoparticles, and the need for a comprehensive review due to the resizing of the microfluidic channels. In parallel with these tests, work has been carried out to miniaturize the experimental device with the aim of creating a lightweight, portable POC test.
Keywords: Microfluidic, Lab on a Chip, Bacteria, POC test, GMR sensors.
Détection de cellules eucaryotes et procaryotes au moyen d’une biopuce équipée de capteurs à magnétorésistance géante
Résumé :
Le développement de méthodes de diagnostic précoce qui soient à la fois rapides, sensibles, portables et économiques sont aujourd’hui un enjeu majeur pour l’amélioration des soins de santé, en particulier en médecine d’urgence ou dans les zones à infrastructures limitées. La détection et la prise en charge rapides des maladies, qu’elles soient infectieuses, chroniques ou émergentes, jouent un rôle central dans la réduction de la mortalité et la maîtrise des épidémies. Consciente de ces besoins, l’Organisation mondiale de la santé (OMS) a proposé dès 2006 un ensemble de critères connus sous l’acronyme REASSURED (Real-time connectivity, Ease of specimen collection, Affordable, Sensitive, Specific, User-friendly, Rapid and robust, Equipment-free, Deliverable to end-users), définissant ainsi les standards que doivent atteindre les tests de diagnostic Point-Of-Care (POC). Pour répondre à ces besoins, l’essor des micro- et nano-biotechnologies au cours des dernières décennies a ouvert la voie à une nouvelle génération de plateformes analytiques miniaturisées. Les technologies dites lab-on-a-chip (laboratoire sur puce) en sont le parfait exemple puisqu’elles permettent d’intégrer, sur des dispositifs de très petite taille, des fonctions autrefois réservées à des laboratoires centralisés et coûteux. Ces technologies ouvrent de nouvelles perspectives pour des tests accessibles, fiables et déployables sur le terrain.
Dans ce contexte, une biopuce brevetée à base de capteurs à magnétorésistance géante (GMR) a été mise au point afin de détecter magnétiquement des cibles biologiques. Cette approche repose sur le marquage magnétique de cibles biologiques à l’aide de nanoparticules magnétiques fonctionnalisées avec des anticorps spécifiquement dirigés contre les cibles d’intérêts. La détection dynamique de ces dernières, introduites dans un canal microfluidique, est effectuée par des capteurs GMR, qui sont disposés face à face de chaque côté du canal microfluidique, permettant de détecter simultanément les cibles biologiques marquées. La première partie de cette thèse est consacrée à une étude préliminaire complète et détaillée de cellules cancéreuses (cellules de myélome murin NS1) afin d’évaluer les performances de la biopuce GMR en tant qu’outil de diagnostic. Pour cela, plusieurs critères tels que la spécificité, la sensibilité, la reproductibilité ainsi que la robustesse de la détection ont été évalués dans une matrice semi-complexe sans prétraitement des échantillons. Les résultats obtenus ont été prometteurs puisque les spécificité et sensibilité des mesures a été démontrée avec une limite de détection moyenne de 500 cellules/mL.
Ces résultats ayant démontrés la pertinence et l’intérêt de la biopuce GMR en tant qu’outil de détection, une seconde étude portant sur la détection de bactéries pathogènes impliquées dans le sepsis a été réalisée. Dans cette seconde partie de l’étude, les travaux ont été effectués sur différentes espèces bactériennes (Salmonella, Enterobacter cloacae et Escherichia coli) qui diffèrent des cellules étudiées auparavant par leur taille (dix fois plus petite) mais aussi par les antigènes exprimés à leur surface. Il a donc fallu effectuer de nombreux tests préliminaires pour choisir les anticorps et les nanoparticules magnétiques les plus adaptés à l’étude de ces nouvelles cibles. La microfluidique de la biopuce a également été modifiée afin de pouvoir détecter les bactéries marquées magnétiquement.
Les résultats obtenus sont encourageants et prouvent qu’une détection de bactéries pathogènes est possible mais met également en lumière la complexité de la sélection de nouveaux anticorps, des difficultés de marquage liées à l’utilisation de nouvelles nanoparticules et une réflexion globale due au redimensionnement des canaux microfluidiques. En parallèle de ces essais, un travail de miniaturisation du dispositif expérimental a été réalisé dans le but de s’approcher au mieux d’un test POC léger et transportable.
Mots-clés : Microfluidique, Biopuce, Bactéries, Test POC, Capteurs GMR.