Une bonne résolution dans le temps et dans l’espace est nécessaire pour caractériser les intermédiaires pendant la formation des interactions spécifiques entre macromolécules ainsi que lors du repliement des ARN et des protéines. Les empreintes par coupure aux radicaux hydroxyle, utilisées pour étudier les interactions macromoléculaires, sont une méthode bien établie. Cependant, le temps nécessaire pour couper un polynucléotide par les méthodes déjà connues (par exemple, la réaction de Fenton) est trop long pour pouvoir étudier la cinétique des changements de conformation des macromolécules. Nos études ont montré que la radiolyse de l’eau par un faisceau intense de rayon X produit suffisamment de radicaux hydroxyle pour couper la chaîne de polynucléotides en quelques dizaines de millisecondes. Le couplage d’une courte exposition aux rayons X avec l’utilisation d’une machine de mélange rapide permet de faire des expériences de cinétique structurale. L’avantage de cette méthode est, qu’en raison de la petite taille des radicaux hydroxyle, le profil de coupure est indicatif de l’accessibilité au solvant du squelette d’ADN et d’ARN. Cette technique représente une sonde qui est sensible aux changements subtils qui apparaissent au cours du repliement de l’ARN ou pendant la fixation d’une protéine sur un site spécifique sur l’ADN. Nous avons utilisé cette technique pour la caractérisation des intermédiaires pendant la reconnaissance du promoteur T7A1 par l’ARN polymérase de E. coli. Nos résultats montrent que la reconnaissance du promoteur commence par des contacts avec la région en amont. Ensuite, les contacts entre la protéine et l’ADN s’étendent pendant deux isomérisations séquentielles, pendant lesquelles il y a des changements conformationels du complexe et l’ouverture de l’ADN. Nous montrons qu’il existe plusieurs structures en équilibre rapide, qui se forment suite à chaque isomérisation dans le chemin cinétique. Ce processus est très similaire à celui qui permet à une protéine de trouver sa conformation la plus stable dans l’espace conformationel. Utilisant la structure de la polymérase publié récemment nous pouvons, avec nos résultats, proposer des structures spécifiques pour chaque intermédiaire dans le chemin cinétique.
LBPA, UMR 8113 CNRS, ENS de Cachan