Manuscript de la thèse / Thesis manuscript
Voir aussi : http://www.theses.fr/s214400#
Résumé :
Les traitements de chimiothérapie ou de radiobiologie visent à générer des cassures double brin (CDB) de l’ADN. Les cellules tumorales sont plus sensibles aux CDBs que les cellules saines en raison de leur phénotype et de leur génotype. Un axe important en radiobiologie est de combiner la radiothérapie avec des inhibiteurs des voies de réparation de l’ADN pour augmenter la radiosensibilité et pallier la résistance aux radiations de certaines cellules cancéreuses. Nos objectifs sont d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la voie NHEJ (Non Homologous End Joining) et de caractériser de nouveaux inhibiteurs spécifiques de cette voie. L’hétérodimère Ku70/Ku80 (Ku) est un acteur central de la voie NHEJ pour la reconnaissance des CDB et dans les événements qui interviennent en aval (étapes de traitement et de ligature). Notre équipe a montré que Ku peut recruter plusieurs facteurs de la voie NHEJ par des interactions directes et coordonne ainsi l’ensemble du NHEJ. De nombreuses interactions impliquent des motifs appelés KBM (Ku Binding Motif). Lorsque les extrémités des CDBs doivent être modifiées, des enzymes sont nécessaires pour corriger les extrémités avant l’étape finale de ligature. L’une de ces enzymes est la protéine Werner (WRN) qui possède deux motifs KBM. Cette protéine fait partie de la famille des hélicases RecQ. Elle est le seul membre de cette famille à posséder en plus de son domaine hélicase, un domaine exonucléase. Elle est particulièrement étudiée dans le cas du syndrome de Werner, une maladie rare à transmission autosomique récessive, caractérisée par un vieillissement précoce. Elle a également été identifiée comme une cible thérapeutique prometteuse pour les cancers présentant une instabilité de l’ADN mais son rôle dans la voie NHEJ est peu connu.
Au cours de ma thèse, j’ai réussi à produire plusieurs constructions WRN et la protéine complète et je les ai étudiés en combinant plusieurs approches structurales. Dans la première partie de ma thèse, nous avons étudié Ku avec des peptides de WRN qui contiennent les KBM et nous avons montré que le motif A-KBM en N-terminal et C-terminal était fonctionnel contrairement au X-KBM, malgré la similarité de séquence avec le X-KBM de XLF. De plus, les complexes Ku-ADN-pWRN présentaient une conformation globale similaire en solution. Dans la deuxième partie de ma thèse, nous avons étudié Ku avec deux constructions de WRN. La première contient le motif A-KBM en N-terminal et le domaine exonucléase et la deuxième construction possède en plus un domaine coiled-coil. Par SEC-SAXS et SEC-MALS, nous avons montré que le domaine coiled-coil permettait la dimérisation de WRN seul. Nous avons déterminé la structure cryo EM du complexe Ku-ADN lié au domaine exonucléase de WRN à 3Å de résolution. Les premières analyses de cette structure ont révélé quatre sites de liaison entre Ku et WRN. La première interaction a montré que le motif A-KBM de WRN a le même site de liaison que le motif A-KBM de APLF. Tous les deux se lient à la périphérie du domaine vWA de Ku80. La deuxième interaction se fait entre Ku80 et le domaine exonucléase et la troisième, entre le domaine exonucléase et le domaine C-terminal de Ku70. La dernière interaction a montré un brin de l’ADN près du site actif du domaine exonucléase. De plus, les données ITC et la structure cryo EM ont suggéré que WRN était présent sous une forme monomérique lorsqu’il était lié à Ku. Dans la dernière partie de ma thèse, nous avons étudié le complexe Ku-WRN entier. Nous avons réussi à coproduire le complexe KuFL-WRN_FL et une première collecte a été faite sur un Titan Krios. Le traitement des données est en cours. Nos collaborateurs ont analysé par imagerie cellulaire et par des tests enzymatiques l’interaction Ku-WRN et ils ont observé un effet stimulateur de Ku sur la fonction exonuclease de WRN, ce qui est en bon accord avec nos données.
Mots-clés :
Contacts : JB Charbonnier (DRF/I2BC), S. Combet (DRF/IRAMIS/LLB), L. Chavas (SOLEIL)
Structural study of the complex formed by the Werner protein (WRN) and the Ku70/80 heterodimer
Abstract:
Keywords:
LLB/MMB