Structure de nano-vésicules hybrides lipides-polymères

Les vésicules hybrides résultant de la combinaison de lipides et de polymères concentrent depuis quelques années les efforts de chimistes, physiciens et biophysiciens du fait de leurs applications dans le domaine de la vectorisation de médicaments, le ciblage de molécules et le relargage contrôlé de principes actifs. Le grand intérêt de ces vésicules réside dans la combinaison des propriétés de ses deux composés.

Les travaux effectués sur ces systèmes au Laboratoire de Chimie des Polymères Organiques visent à déterminer les conditions chimiques et physico-chimiques d'élaboration de telles vésicules ainsi que leurs propriétés. Parmi plusieurs techniques d'études structurales, une méthode de choix est la diffusion de neutrons aux petits angles (DNPA), pratiquée au Laboratoire Léon Brillouin, qui, combinée au marquage par deutération, permet de déterminer les caractéristiques de ces nano-objets et de montrer le caractère hybride des vésicules.

Les structures observées de vésicules mixtes, composées d'un copolymère (polydimethylsiloxane greffé avec des blocs de polyoxyéthylène (PDMS-g-(PEO)₂) et de phospholipide DPPC (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), montrent la présence de domaines nanométriques de lipides au sein des membranes, résultant d'une séparation de phase entre les polymères amphiphiles et les lipides. Cette étude précise ainsi les procédés pour obtenir et moduler la structure des membranes structurées, notamment en vue d’applications de ciblage.

Les vésicules hybrides présentent une membrane mixte de polymères biocompatibles et de phospholipides (composants naturels des membranes biologiques). Leur intérêt réside dans la combinaison des propriétés des deux composés : perméabilité, biodégradabilité et furtivité par rapport aux cellules biologiques des lipides et versatilité de fonctionnalisation chimique, résistance et élasticité des polymères. De plus leur faible taille et la nano-structuration résultant de la séparation de phase entre lipides et polymères dans la membrane leur apporte des propriétés de viscosité et déformabilité qui peuvent être ajustées [1].

Pour exploiter au mieux le potentiel de telles structures, la formulation des lipides doit être étudiée, afin qu’elle se rapproche le plus de celles des membranes des cellules biologiques. Les paramètres physiques et moléculaires qui pilotent le diagramme de phase de ces membranes hybrides doivent ensuite être maitrisés. Un des objectifs de la présente étude est de définir les conditions qui conduisent à la formation de nano-domaines enrichis (ou purs) de lipides et de polymères. On peut déjà noter qu'en plus de l'incompatibilité chimique attendue entre les chaînes des blocs polymériques et celles des lipides, leur différence de taille contribue déjà à favoriser une séparation des deux constituants. Un autre paramètre important est la tension de ligne d'interface entre domaines, qui résulte de la différence d'épaisseur entre les domaines de lipides et la membrane polymérique environnante.

Afin de minimiser cette tension de ligne, pour obtenir des nano-ojets stables, nous avons utilisé un copolymère flexible, le PDMS-g-(PEO)₂ (ou polydiméthylsiloxane, greffé avec deux fragments pendants de polyoxyéthylène) de masse moléculaire M_w=3000 g/mole. Ce copolymère forme des vésicules ayant une épaisseur de membrane (~ 5 – 6 nm [2] proche de celle des liposomes (~ 3 – 4 nm). Il a été mélangé avec du DPPC (1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine) dans le rapport massique polymère/lipide ~ 80/20. La petite différence de longueur de chaîne hydrophobe entre les polymères et les chaînes aliphatiques des lipides ainsi que la flexibilité du copolymère facilitent l’adaptation conformationnelle des deux composés dans la membrane. Les vésicules sont préparées par électro-formation de solutions de membranes séchées, puis extrudées 21 fois au travers de membranes poreuses calibrées, afin d’obtenir des vésicules de diamètre homogène (100 nm). Les solutions ainsi obtenues ont été analysées par diffusion de lumière statique et dynamique afin d'observer la distribution en taille des vésicules. Le rayon moyen se trouve être en bon accord avec le rayon hydrodynamique R_H. Les images de cryo-microscopie en transmission (Figure 1) montrent les vésicules ainsi obtenues.

Pour obtenir plus d'informations à l'échelle moléculaire sur la structure des membranes de ces vésicules hybrides, des expériences de DNPA ont été réalisées en utilisant du DPPC avec des chaînes aliphatiques complètement deutérées (d62-DPPC). De plus, afin de séparer dans le spectre de diffusion la contribution des lipides de celle des copolymères, des mélanges de solvants D₂O/H₂O ont été utilisés, de façon à annuler soit le signal issu du polymère, soit le signal issu du lipide, ceci permettant d’observer la contribution isolée de chacun des composants.

Les courbes de diffusion pour les vésicules dans l'eau s'interprète aisément avec un modèle de vésicule tridimensionnel. Celles où l’on observe les lipides seuls s'interprètent de façon consistante, avec une structure en domaines sous forme de disques compacts environnés par des membranes composées de copolymères [3]. Les courbes de diffusion obtenues en annulant la contribution au signal des lipides n’ont pas pu être ajustées et de nouveaux modèles de diffusion par des vésicules perforées doivent être développés.

L'étude en température montre que pour des vésicules de 100 nm, les nano-domaines de lipides sont préservés, même à des températures où les lipides doivent être en phase fluide (à 46°C) et non plus en phase gel (à 20°C). Cette stabilité en température, liée à la taille nanométriques des vésicules est un avantage par rapport aux vésicules de grandes tailles, usuellement très instables.

Ces expériences de DNPA apportent ainsi les informations structurales nécessaires sur les vésicules obtenues à partir de polymères flexibles et de bicouches de lipides. La stabilité en température observée des vésicules hybrides nanométriques est un atout majeur en vue des applications potentielles dans le domaine du transport et du relargage ciblé de principes actifs, qui incite à poursuivre l'étude. Serons en particulier étudiées d’autres architectures de copolymères flexibles, élaborées avec plusieurs lipides et différentes fractions copolymère/lipide, afin d'explorer de la façon la plus large possible l'ensemble du diagramme de phase de ce système, attractif de par ses potentialités applicatives.

Contact CEA-IRAMIS : Annie Brûlet (LLB)

Collaboration :

• T. P. T. Dao, R. Salva, O. Sandre, J-F. Le Meins : Laboratoire de Chimie des Polymères Organiques, UMR 5629, F-33600, Pessac, France
• A. Brûlet : Laboratoire Léon Brillouin, UMR 12, CEA-Saclay, CEA-CNRS, 91191 Gif-sur-Yvette Cedex, France
• F. Fernandes, M. Prieto : Centro de Química-Física Molecular and Institute of Nanoscience and Nanotechnology, Universidade de Lisboa Instituto Superior Técnico, 1049-001 Lisboa, Portugal
• M. Er-Rafik, M. Schmutz : Institut Charles Sadron, UPR 22 CNRS, Université de Strasbourg, 23 rue du Loess, 67034 Strasbourg, France.