Laboratoire Léon Brillouin

UMR12 CEA-CNRS, Bât. 563 CEA Saclay

91191 Gif sur Yvette Cedex, France

+33-169085241 llb-sec@cea.fr

Let's scatter neutrons

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Biophysical characterization of the membrane protein mTSPO

Spécialité

Biophysique

Niveau d'étude

Bac+5

Formation

Master 2

Unité d'accueil

Candidature avant le

01/04/2024

Durée

6 mois

Poursuite possible en thèse

oui

Contact

COMBET Sophie
+33 1 69 08 67 20

Résumé/Summary
L’objectif de ce stage est de caractériser la structure de la protéine transmembranaire mTSPO et son affinité pour des ligands d’intérêt pharmacologique. L’étude se fera en conditions natives, en exprimant mTSPO chez la levure et en la solubilisant dans des environnements biomimétiques. Nous utiliserons des outils biophysiques (spectroscopie optique et SAXS) couplés à de la modélisation ab initio.
The objective of this internship is to characterize the structure of the transmembrane protein mTSPO and its affinity for ligands of pharmacological interest. The study will be carried out in native conditions, by expressing mTSPO in yeast and solubilizing it in biomimetic environments. We will use biophysical tools (optical spectroscopy and SAXS) coupled with ab initio modeling.
Sujet détaillé/Full description
Caractérisation biophysique de la protéine membranaire mTSPO

Nous nous intéressons à la structure/fonction de la protéine TSPO (TranSlocator PrOtein), une protéine membranaire ubiquitaire de 18 kDa, à cinq hélices transmembranaires. C’est une protéine d’intérêt pharmacologique majeur car elle utilisée comme cible de ligands pour le diagnostic et la thérapie de plusieurs pathologies inflammatoires et cancéreuses et comme marqueur de maladies neurodégénératives.
Deux structures bactériennes de TSPO ont été résolues par diffraction de rayons X en phase cubique lipidique, alors que toutes les tentatives pour obtenir des cristaux de TSPO de mammifère ont échoué jusqu’à présent. La structure RMN de la TSPO de souris (mTSPO) a été résolue, mais est controversée car en détergent DPC (déstabilisant) et en présence du ligand de haute affinité PK 11195 qui rigidifie fortement sa structure. Aucune structure de mTSPO à haute résolution sans ligand et dans un environnement membranaire biomimétique n’a encore été obtenue.
L’obtention d’une telle structure reste donc un challenge et permettrait de comprendre la fixation et la stabilité des ligands dans les cavités de mTSPO et leur rôle dans les changements de conformation de la protéine, ce qui est essentiel pour le développement de nouvelles molécules pour l'imagerie et les thérapies.
Nous produisons actuellement mTSPO par surexpression dans E. coli. La protéine est extraite à partir des corps d’inclusion de la bactérie en détergent SDS, très chargé, où elle stable et monodisperse mais sous une forme non fonctionnelle. Le changement du SDS par le DPC et surtout par des mélanges mixtes lipides:détergents (DMPC:DPC) conduit à une structure plus native de mTSPO, capable de lier des ligands, avec une augmentation du taux d’hélices et une compaction de la conformation de la protéine1.
Un premier objectif de ce projet de stage est de produire la protéine mTSPO sous forme native par voie recombinante chez la levure Saccharomyces cerevisiae. La protéine s’exprime à la membrane externe des mitochondries, ce qui permet de la solubiliser et la purifier dans des conditions natives, contrairement au protocole chez E. coli. La protéine de fusion GFP (fluorescente) permet de tracer l’extraction et la purification de mTSPO. Nous avons réalisé récemment ce protocole de façon qualitative grâce à l’expertise du plateau technique de production de protéines membranaires de l’I2BC (Saclay). Cette partie sera à améliorer et à appliquer pour purifier la protéine mTSPO dans de nouveaux environnements, notamment le détergent DDM connu pour favoriser la cristallisation protéique.
Le second objectif du stage sera de caractériser la taille et la structure de mTSPO produite chez la levure par des mesures de spectroscopie optique (absorbance, fluorescence et dichroïsme circulaire), de diffusion de lumière (SEC-MALLS) et de diffusion de rayons X aux petits angles (SEC-SAXS au synchrotron SOLEIL), dans différents environnements amphiphiles (détergents dont le DDM, mélanges lipides:détergents et nanodisques de phospholipides), en présence ou pas de ligands (PK, cholestérol).

Profil recherché : étudiant(e) en biophysique et/ou biochimie et/ou physico-chimie fortement intéressé(e) par la biologie structurale. Une poursuite en thèse est envisageable.
Ce stage sera basé au Laboratoire Léon-Brillouin (LLB, site du CEA/Saclay, Univ. Paris-Saclay), en étroite collaboration avec le Dr. José Luis Vazquez-Ibar (I2BC, Univ. Paris-Saclay) et le Dr. Françoise Bonneté (IBPC, Paris).
Contact : Dr. Sophie COMBET (DR CNRS)
01 69 08 67 20 ; sophie.combet@cea.fr

1 https://doi.org/10.1016/j.biochi.2022.11.014
Mots clés/Keywords
physique du vivant, biochimie
physics in life science, biochemistry
Compétences/Skills
spectroscopie optique, diffusion de rayons X aux petits angles en synchrotron, biochimie des protéines membranaires
optical spectroscopy, synchrotron X-ray small-angle scattering, membrane protein biochemistry
Logiciels
la connaissance de Python est un plus mais n'est pas indispensable
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Wetting dynamics of polymer liquids from the macro to the nanoscale

Spécialité

Physique des liquides

Niveau d'étude

Bac+5

Formation

Master 2

Unité d'accueil

Candidature avant le

17/04/2024

Durée

5 mois

Poursuite possible en thèse

oui

Contact

GRZELKA Marion
+33 1 69 08 60 57

Résumé/Summary
L'objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes de dissipation d'énergie lors de l'étalement spontané d'une goutte sur un substrat nanotexturé. Dans le cadre de ce stage, l'étudiant étudiera le mouillage de surfaces nanotexturées grâce à des techniques conventionnelles de microscopie optique (échelles macroscopiques sondées), et de réflectivité des rayons X (échelles nanoscopiques sondées).
The aim of this project is to understand the mechanisms of energy dissipation during spontaneous spreading of a drop on a nanotextured substrate. As part of this internship, the student will study the wetting of nanotextured surfaces by conventional optical microscopy techniques (to probe macroscopic scales) and X-ray reflectivity (to probe nanoscopic scales).
Sujet détaillé/Full description
Les situations où un liquide recouvre une surface, connues sous le nom de mouillage dynamique, sont aujourd'hui bien comprises lorsque des liquides se répandent sur des substrats solides atomiquement plats. Cependant, la majorité substrats réels ne sont pas atomiquement plats, compliquant la compréhension de ce phénomène. La difficulté majeure pour le décrire vient de la large gamme d'échelles de longueur impliquées, de la taille millimétrique d'une goutte à la gamme nanométrique de l'interaction liquide/substrat.
En effet, les mécanismes de dissipation d'énergie à la ligne de contact sont encore largement inconnus sur les surfaces rugueuses. Sur des surfaces atomiquement plates et chimiquement homogènes, il a été démontré qu'un film, appelé film précurseur, précède la goutte macroscopique. La présence de ce film a été prédite théoriquement, mais a été difficile à observer expérimentalement en raison de sa faible épaisseur (<100 nm). La question de savoir comment la rugosité nanométrique, dont la taille caractéristique est proche de l'épaisseur du film précurseur, influence les comportements d'étalement reste ouverte.

Le but de ce projet est de comprendre comment une rugosité purement topographique à l'échelle nanométrique affecte la dynamique d'étalement spontané d'un liquide. Notamment, un film précurseur peut-il se former et se propager ? Quels sont les mécanismes de dissipation d’énergie en jeu lors du mouillage de surface nanotexturées ?
Dans le cadre de ce stage, l'étudiant préparera et caractérisera (microscopie à force atomique et réflectivité des rayons X) les surfaces nanotexturées. Il étudiera ensuite le mouillage de ces surfaces par des gouttes de polymères liquides. Les techniques conventionnelles de microscopie optique seront utilisées pour sonder les échelles macroscopiques. Les échelles nanométriques seront sondées par réflectivité des rayons X (appareil disponible au LLB).
Situations where a liquid covers a surface, known as dynamic wetting, is nowadays well understood when liquids spread on flat solid substrates. Nevertheless, real life substrates are not atomically flat. Then, a difficulty to describe this phenomenon comes from the broad range of length scales involved, from the millimeter size of a drop to the nanometric range of
the liquid/substrate interaction.
Indeed, energy dissipation mechanisms at the contact line are still largely unknown on rough surfaces. On atomically flat, chemically homogeneous surfaces, it has been shown that a film, known as the precursor film, precedes the macroscopic drop. The presence of this film was predicted theoretically, but was difficult to observe experimentally due to its small thickness (<100 nm). How nanometric roughness, with a characteristic size close to the precursor film thickness, influences the spreading behaviors is still an open question.

The aim of this project is to understand how purely topographic roughness at the nanoscale affect the spontaneous spreading dynamics of a liquid. Notably, can a precursor film form and propagate ? What are the energy dissipation mechanisms involved in wetting nanotextured surfaces?

In this internship, the student will prepare and characterize ( atomic force microscopy and X ray reflectivity) the nanotextured surfaces. They will then study the wetting of these surfaces with silicone oils. Conventional optical microscopy techniques will be used to probe macroscopic scales. Nanometric scales will be probed by X ray reflectivity (device available at LLB).
Mots clés/Keywords
Mouillage, frottement, nanorugosité, réflectivité de rayons X
wetting, friction, nanoroughness, X-ray reflectivity
Compétences/Skills
- AFM - microscopie classique - réflectivité de rayons X
- AFM - classical microscopy techniques - X ray reflectivity
Logiciels
Python ou Matlab

 

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