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| 1 sujet IRAMIS |
Dernière mise à jour :
Identification du repliement tri-dimensionnel d’ARN messagers viraux par dichroïsme circulaire
SL-DRF-23-0740
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Date souhaitée pour le début de la thèse : 01-04-2023
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Page perso : http://iramis.cea.fr/Phocea/Membres/Annuaire/index.php?uid=varluiso
Labo : http://iramis.cea.fr/LLB/MMB/
Les acides ribonucléiques (ARN) jouent un rôle crucial dans la cellule. De la même manière que les protéines, ils peuvent adopter une structure qui résulte généralement de l'assemblage de sous-structures minimales (appelées structures secondaires) en une structure plus complexe appelée structure tertiaire. Nos analyses, réalisées entre autres au synchrotron SOLEIL, ont montré que la technique de Dichroïsme Circulaire (CD) ou de Dichroïsme Circulaire sur Synchrotron (SRCD) fournit des informations détaillées sur la conformation des ARNs, notamment concernant les paramètres hélicoïdaux et l'empilement et l’appariement des bases (Le Brun et al., 2020 ; Wien et al., 2021).
Récemment, des vaccins utilisant des ARN messager (ARNm) encapsulés dans des nanoparticules lipidiques (LNPs) agissant comme vecteurs sont apparus sur le marché pharmaceutique (Hou et al., 2021). Ceux-ci utilisent des nucléotides modifiés tels que la méthyl-pseudouridine, pour stabiliser l’ARNm (Morais et al., 2021). De plus, il a aussi été observé que la méthode d’encapsulation des ARNm dans des LNPs (par des méthodes type « T-mix », « cross-flow » … (Evers et al., 2018)), ainsi que la composition lipidique des LNPs peuvent influencer l’efficacité vaccinale. La caractérisation structurale des ARNm au sein des LNPs est donc un élément critique afin d’optimiser la formulation et les méthodes d’assemblage de ces vaccins. En ce sens, il est donc indispensable de disposer d’une approche analytique donnant accès à la structure 3D des ARNm issus de la transcription encapsulés au sein des LNPs. Cette méthode doit être rapide, peu consommatrice d'échantillon et devra permettre une analyse cinétique des changements structuraux au cours de l’encapsulation. En ce sens, le Dichroïsme Circulaire est une méthode de choix pour cette analyse car elle permet d’analyser rapidement et facilement des ARN en solution en enregistrant des spectres d’absorption de la lumière polarisée, précisément de la différence entre la lumière polarisée circulairement gauche et droite. Compte tenu de la présence du ribose chiral relié aux bases qui absorbent la lumière dans la bande spectrale des ondes ultra-violets (UV), ces molécules peuvent être analysées en CD dans l’UV proche ou lointain (320-170 nm). Les changements structuraux des ARN dus à la salinité, au pH et à la température, etc… peuvent donc être suivis au cours du temps y compris dans le contexte des LNPs utilisés pour les vaccins.
Grâce à son extension spectrale jusqu’à 170 nm, la technique de SRCD est donc la méthode la plus adaptée car elle donne accès aux transitions électroniques dites de « transfert de charges » intra moléculaires des polynucléotides, qui permettent une analyse complète de la structure des ARNm. Cependant, à ce jour, une approche théorique déterminant « ab-initio » les spectres CD/SRCD basée sur la composition des polynucléotides n’existe pas. Ainsi, la méthode de CD est considérée comme une méthode heuristique, et l’interprétation des spectres ne peut se faire sans une « bibliothèque de référence » complète incluant des ARN y compris avec des nucléotides modifiés.
Récemment, des vaccins utilisant des ARN messager (ARNm) encapsulés dans des nanoparticules lipidiques (LNPs) agissant comme vecteurs sont apparus sur le marché pharmaceutique (Hou et al., 2021). Ceux-ci utilisent des nucléotides modifiés tels que la méthyl-pseudouridine, pour stabiliser l’ARNm (Morais et al., 2021). De plus, il a aussi été observé que la méthode d’encapsulation des ARNm dans des LNPs (par des méthodes type « T-mix », « cross-flow » … (Evers et al., 2018)), ainsi que la composition lipidique des LNPs peuvent influencer l’efficacité vaccinale. La caractérisation structurale des ARNm au sein des LNPs est donc un élément critique afin d’optimiser la formulation et les méthodes d’assemblage de ces vaccins. En ce sens, il est donc indispensable de disposer d’une approche analytique donnant accès à la structure 3D des ARNm issus de la transcription encapsulés au sein des LNPs. Cette méthode doit être rapide, peu consommatrice d'échantillon et devra permettre une analyse cinétique des changements structuraux au cours de l’encapsulation. En ce sens, le Dichroïsme Circulaire est une méthode de choix pour cette analyse car elle permet d’analyser rapidement et facilement des ARN en solution en enregistrant des spectres d’absorption de la lumière polarisée, précisément de la différence entre la lumière polarisée circulairement gauche et droite. Compte tenu de la présence du ribose chiral relié aux bases qui absorbent la lumière dans la bande spectrale des ondes ultra-violets (UV), ces molécules peuvent être analysées en CD dans l’UV proche ou lointain (320-170 nm). Les changements structuraux des ARN dus à la salinité, au pH et à la température, etc… peuvent donc être suivis au cours du temps y compris dans le contexte des LNPs utilisés pour les vaccins.
Grâce à son extension spectrale jusqu’à 170 nm, la technique de SRCD est donc la méthode la plus adaptée car elle donne accès aux transitions électroniques dites de « transfert de charges » intra moléculaires des polynucléotides, qui permettent une analyse complète de la structure des ARNm. Cependant, à ce jour, une approche théorique déterminant « ab-initio » les spectres CD/SRCD basée sur la composition des polynucléotides n’existe pas. Ainsi, la méthode de CD est considérée comme une méthode heuristique, et l’interprétation des spectres ne peut se faire sans une « bibliothèque de référence » complète incluant des ARN y compris avec des nucléotides modifiés.
