Ce chapitre présente les développements récents ainsi que les projets de recherche, en Biologie, qui rentrent dans le cadre d’une recherche interdisciplinaire. Les problématiques sont centrées sur des études de la structure et de la dynamique de macromolécules biologiques, dans l’état natif (protéines globulaires solubles, protéines membranaires, acides nucléiques, membranes modèles) et dans des états dénaturés (protéines solubles), avec le souci de mieux comprendre le repliement des protéines. Cependant, nous allons au delà de la caractérisation des structures statiques et dynamiques et considérons l’apport d’informations émanant d’autres techniques expérimentales ou de la théorie et nécessaire à résoudre nos problématiques.

L’étude des solutions de protéines et, en particulier, des états dénaturés des protéines, est une activité importante du laboratoire; la diffusion des neutrons permet d’utiliser un fort dénaturant, avec des concentrations élevées en solution, comme le chlorure de guanidinium, ce qui n’est pas possible avec les rayons X, à cause de la forte absorption du chlore.

Il est établi que les structures, mais aussi les mouvements atomiques et moléculaires, permettent aux protéines et aux acides nucléiques de remplir leurs fonctions biologiques. Cependant, si l’on connaît un grand nombre de structures cristallographiques de protéines avec une bonne résolution, on ne sait pas comment ces structures se déforment au cours du temps pour assurer la fonction de la protéine. Différentes échelles de temps interviennent dans le déroulement de la physiologie moléculaire, allant de la femtoseconde (transitions électroniques) à la milliseconde (réaction enzymatique),et dans lequel l’eau d’hydratation joue un rôle prédominant. Nous cherchons actuellement à mieux comprendre la corrélation qui existe entre la dynamique interne d’une protéine et sa fonction biologique en développant les études de la dynamique à différ ntes échelles de temps. Le domaine temporel accessible uniquement par les neutrons correspond à la gamme de 10^-12s (agitation thermique, mouvements de chaînes latérales) à 10^-9s (diffusion, mouvements de domaines). La difficulté face à des systèmes aussi complexes que les protéines est d’établir la relation entre la dynamique et la structure afin de dégager des données pertinentes en biologie. Nous avons choisi des systèmes pour lesquels la structure cristallographique est connue. Cette activité relative à la relation structure-dynamique-fonction d’une macromolécule biologique s’est développée rapidement et fait l’objet de nombreux résultats.

Les mesures présentées dans ce chapitre utilisent des techniques de diffusion de neutrons telles que la diffusion aux petits angles, qui est essentielle pour accéder à l’information sur la structure à grande échelle. La diffusion inélastique de neutrons permet d’atteindre des domaines temporels allant de la picoseconde à la nanoseconde (appareils à temps de vol, appareils à échos de spin) ; en particulier, la diffusion incohérente de neutrons est une technique unique pour étudier les mouvements individuels des protons, au sein d’une protéine, puisqu’elle bénéficie du fait que la diffusion de l’hydrogène domine largement celle des autres atomes. D’autre part, la diffusion inélastique cohérente renseigne sur les mouvements collectifs des espèces au sein d’un système.

La méthode de variation de contraste, associée à la substitution isotopique H/D, est couramment utilisée dans la technique de diffusion de neutrons aux petits angles. On l’utilise également dans les études de la dynamique des systèmes biologiques. C’est une méthode puissante, car, par deutériation sélective d’un échantillon, on isole en quelque sorte l’information sur la dynamique de la partie protonée qui nous intéresse, la partie deutériée diffusant beaucoup moins; on est ainsi amené à différencier les mouvements des différentes parties fonctionnelles des macromolécules biologiques. Mais le marquage isotopique, qui est relativement aisé en ce qui concerne le proton de l’eau, est difficile pour les protons d’une protéine. Une collaboration avec le laboratoire national d’Argonne aux USA nous a permis d’obtenir la protéine C-phycocyanine &a rave; l’état deutérié, qui est un échantillon unique, et d’effectuer des études de la dynamique de cette protéine globulaire. Cependant il y a de grands espoirs, à l’heure actuelle, avec les progrès de l’ingéniérie des protéines et les méthodes de clonage et d’expression des gènes, de disposer de protéines deutériées sélectivement. C’est le cas de la néocarzinostatine.

Pour résoudre les problématiques énoncées ci-dessus, nous ne limitons pas nos efforts à l’unique usage des techniques de diffusion de neutrons, mais nous associons à celles-ci d’autres techniques, telles que la diffusion des rayons X aux petits angles, le dichroïsme circulaire, la fluorescence statique, la fluorescence résolue en temps, la calorimétrie différentielle qui, en particulier, ont apporté des informations complémentaires dans les études des états dénaturés des protéines. La résonance magnétique nucléaire (RMN) du solide du carbone 13 en abondance naturelle s’est avérée très complémentaire dans les études de la dynamique des protéines.

Il est important de connaître parfaitement les échantillons biologiques que nous utilisons. Dans certains cas, ces échantillons exigent un protocole particulier de préparation comprenant l’extraction, la purification, la caractérisation du système biologique. Nos étudiants en thèse se rendent dans les laboratoires avec lesquels nous collaborons pour préparer eux-mêmes ces échantillons ; ils bénéficient de plus d’une formation en biologie. Les étapes suivantes concernant, soit l’hydratation des poudres, dans le cas des protéines globulaires, soit la préparation des solutions de protéines, sont réalisées au laboratoire.

Ces deux dernières années ont été marquées par les activités suivantes :

1) Le repliement des protéines est un phénomène fondamental, tant du point de vue biologique que physique. Comprendre comment une protéine acquiert sa configuration native fonctionnelle est l’un des grands problèmes de la biologie actuelle. Les travaux en cours ont donc pour but d’expliquer le mécanisme de repliement des protéines mais aussi de connaître la structure et la dynamique des états dénaturés. Un travail très approfondi, relatif à la phosphoglycérate kinase et utilisant diverses techniques a fait l’objet de la thèse que V. Receveur a soutenu le 28 avril 1997. Une nouvelle thèse a démarré en novembre 1996 (D. Russo) : elle concerne également l’étude de la structure et de la dynamique des états dénaturés des protéines. Dans le cadre de cette thèse, on a choisi de travailler, entre autres, sur une proté ne, la néocarzinostatine qui présente, dans l’état natif, une structure secondaire caractérisée par des feuillets b , donc différente de celle de la phosphoglycérate kinase. Le mode de repliement des structures purement b est très mal connu (Collaboration avec le Laboratoire de Modélisation et d’Ingénierie des Protéines, Orsay).

2) L’agrégation est un phénomène mal connu. Des travaux ont été entrepris dans ce domaine et portent sur la structure de la caséine b et des micelles que cette protéine forme naturellement en solution ( Thèse de E. Leclerc, 15 novembre 1996).

3) La cristallisation des protéines est toujours d’actualité et continue de faire l’objet de travaux comme c’est le cas pour le lysozyme. La compréhension de ce processus passe, en particulier, par une meilleure connaissance de l’hydratation des protéines. Dans ce but, des mesures de la solubilité du lysozyme, à la fois dans l’eau légère et dans l’eau lourde ont été réalisées et permettent d’obtenir des courbes maîtresses de la solubilité en fonction de la densité de l’eau.

Les études qui sont commentées ci-dessous concernent des poudres lyophilisées de protéines dont on a fait progressivement varier l’hydratation depuis ‘l’état sec’ jusqu'à la situation dans laquelle se trouve la protéine en solution. Cette étape est indispensable pour juger des effets de l’hydratation progressive sur la dynamique, donc sur la fonction de la protéine, avant de réaliser les expériences en solution comme il est prévu dans les projets futurs.

La dynamique interne des parvalbumines apparaît intimement associée aux propriétés d’échange cationique. Les travaux, par diffusion quasi-élastique et inélastique incohérente de neutrons, ont permis d’établir une preuve directe du lien entre la dynamique interne de la protéine et la taille du cation métallique (Ca²⁺ et/ou Mg²⁺) fixé sur la protéine. La compréhension des mécanismes moléculaires d’échange cationique, en relation avec la dynamique moléculaire, présente donc un réel intérêt dans le cas des parvalbumines pour lesquelles une corrélation étroite entre dynamique interne et fonction biologique paraît se préciser. De plus, un premier pas vers la connaissance fine de la dynamique de la parvalbumine, induite par l’eau d’hydratation, a été possible par la mise en parall&egra e;le des résultats de diffusion de neutrons et de ceux obtenus par RMN du solide du carbone 13 en abondance naturelle (Collaboration avec le Groupe de Biochimie Structurale, Montpellier). Les informations issues de ces deux techniques ont permis de montrer que l’hydratation d’une poudre de parvalbumine, induisait la diffusion, en particulier, des lysines qui sont très hydrophiles et présentes en grand nombre, à la surface de la protéine (Thèse de J.-M. Zanotti, 27 janvier 1997).

La protéine C-phycocyanine est impliquée dans le processus de la photosynthèse de type II. En particulier, la dynamique de l’eau d’hydratation (H₂O), à la surface de cette protéine deutériée à 99%, a été étudiée avec précision par diffusion quasi-élastique et inélastique incohérente de neutrons, en fonction de la température et du taux d’hydratation de la protéine (Thèse de J.-M. Zanotti).

Nous avons entrepris l’étude de la dynamique de cette protéine deutériée et avons mesuré le facteur de Debye-Waller cohérent, en fonction de la température et du taux d’hydratation de la protéine. On ne commence à détecter des mouvements impliquant, soit des résidus hydrophiles, soit des domaines de la protéine, que pour des degrés d’hydratation (g d’eau par g de protéine) supérieurs à 0.25. Ces résultats combinent des expériences couvrant une gamme temporelle de la picoseconde (Mibémol, LLB) à plusieurs nanosecondes (appareil à échos de spin de neutrons, LLB, ILL). Des études en diffusion quasi-élastique incohérente de neutrons, à temps court, réalisées sur la même protéine hydrogénée, doivent compléter ces résultats (Thèse de S. Dellerue, en cours).

Les protéines membranaires photosynthétiques sont impliquées dans les étapes primaires de la photosynthèse bactérienne. La première étape du processus photosynthétique bactérien est la capture de la lumière solaire par les protéines antennes, qui assurent aussi le transport de cette énergie sous forme d’excitations jusqu’aux centres réactionnels. Dans les centres réactionnels, l’arrivée de cette énergie d’excitation induit le transfert d’un électron au travers de la membrane photosynthétique, ce qui correspond à la première étape de la transduction de l’énergie lumineuse en énergie chimique.

On ne connaît la structure tridimensionnelle, à l’échelle atomique, que d’un tout petit nombre de protéines membranaires, et l’on comprend encore mal les relations entre structures et fonctions pour cette classe de protéines. En particulier, on ne dispose encore que de très peu d’informations sur leur dynamique, qui doit comporter des aspects spécifiques par rapport à celle des protéines solubles : les protéines membranaires sont-elles plus flexibles que les protéines solubles? Comment se déforment dans le temps les faisceaux d’hélices a qui les caractérisent? Quelle est l’influence de leurs solvants associés (lipides membranaires, eau, détergents) sur leur dynamique?

Les premières expériences, par diffusion quasi-élastique et inélastique incohérente de neutrons, ont été réalisées avec des protéines antennes (LH2), solubilisées en présence d’un détergent, puis en présence de lipides deutériés représentant au mieux la membrane biologique native. Elles ont permis de détecter des mouvements locaux à temps court et montrent que les protéines LH2 ont des comportements dynamiques, dans cette gamme de temps, assez différents suivant que l’on se trouve en présence d’un détergent ou de lipides.

Ces études sont poursuivies actuellement sur d’autres protéines membranaires comme les centres réactionnels, et sur le complexe formé par une protéine LH1 et le centre réactionnel, toujours en présence d’une membrane lipidique. De plus, dans le cadre de la relation structure-fonction, nous envisageons de comparer la dynamique des protéines membranaires avec celle de la C-phycocyanine qui possède une majorité d’hélices a (Thèse de S. Dellerue, en cours, codirigée avec B. Robert, Section de Biophysique des Protéines et des Membranes, Saclay).

Les mesures sont réalisées sur des membranes modèles. Les études adoptent la même stratégie que précédemment où les études structurales, en fonction de la température, sont parfois couplées aux études de la dynamique, à temps long. Des résultats nouveaux ont été obtenus. En particulier, des informations sur la structure des domaines des membranes ainsi que sur la nature de l’interface délimitant ces domaines ont été obtenues, pour la première fois, pour des échantillons de membranes de DMPC/DSPC. Dans le cas de membranes simples de DMPC, on a mis en évidence que la membrane perdait une partie de sa rigidité pour devenir plus ‘molle’ au voisinage de la température critique.

 D) Les études relatives à l’ADN

Ces études sont centrées autour de deux thèses en cours, codirigées avec J.-L. Sikorav, (Direction des Sciences du Vivant du CEA), relatives aux thèmes suivants pour lesquels le Laboratoire Léon Brillouin apporte sa connaissance approfondie de la physico-chimie des polymères, ainsi que certaines techniques expérimentales (diffusion de neutrons, diffusion de la lumière, mesures de viscosité).

D1. Les cinétiques de renaturation de l’ADN (Thèse de I. Chaperon)

La réaction de renaturation qui est la reconstitution de la double hélice à partir de ses deux brins est la base de la méthode d’hybridation en génétique moléculaire. La vitesse de la renaturation normale est connue et on sait comment accélérer ce processus. Les méthodes développées ici ont consisté à étudier le processus de renaturation en présence de cations multivalents ou d’une émulsion eau phénol. A partir des diagrammes de phase obtenus, on a pu extraire des informations sur l’accélération de la cinétique de renaturation.

D2. La dynamique de l’ADN et des chromosomes : l’étude in vitro du couplage ADN-Topoisomérase (Thèse de D. Jary)

Les enzymes topoisomérases II catalysent le passage d’une chaîne d’ADN à travers une autre chaîne. Cette action fixe l’échelle des temps dans les solutions semi-diluées. Le système couplé présente des analogies et des différences avec les polymères vivants (qui ont été étudiés par diffusion de neutrons aux petits angles). Les études en cours ont pour but de vérifier que l’on peut reproduire in vitro les conditions nécessaires à l’activité enzymatique, observée in vivo. Des études de la cinétique de cyclisation de l’ADN ainsi que de la dynamique de chaînes d’ADN, en solutions semi-diluées, sont en progrès.

Il est important de conclure cette partie, relative aux activités de recherche, par un bilan sur les doctorants que nous préparons. Deux thèses ont été soutenues dernièrement, deux autres thèses sont en cours et deux nouvelles thèses ont débuté en octobre 1996. Ces thèses se font en étroite interaction avec des laboratoires de Biologie, du CEA ou universitaires/ CNRS. Un de nos doctorants en Biologie (J.-M. Zanotti) vient d’être recruté au LLB sur un poste CEA. Ceci montre que les activités liées à la Biologie sont en plein développement au laboratoire.

Depuis ces deux dernières années, on note donc une progression importante de l’activité en biologie, avec soit le développement des thématiques en cours, soit l’orientation vers de nouvelles thématiques comme la dynamique des protéines membranaires. L’étude des états dénaturés des protéines a fait l’objet de résultats nouveaux. En particulier, on a obtenu des informations sur la dynamique à temps court d’une protéine dépliée, ainsi que sur la structure des états intermédiaires de repliement. On s’oriente actuellement vers l’étude des états dénaturés sous pression, tout en continuant à étudier les effets d’un dénaturant chimique et/ou de la température.

Les résultats relatifs à la dynamique des protéines sont très encourageants. C’est la raison pour laquelle on a commencé à étendre l’étude de la relation structure-dynamique-fonction, en fonction du degré d’hydratation et de la température, à d’autres protéines globulaires solubles (lysozyme, myoglobine), pour lesquelles les informations sur la dynamique sont très fragmentaires. L’utilisation de techniques variées telles que la diffusion de neutrons avec différentes résolutions en énergie, la diffusion des rayons X, la RMN, les simulations numériques, etc., pourrait permettre d’accéder à une description détaillée de la dynamique de ces systèmes. Cependant, cette stratégie d’étude exige un accès aisé à tous ces dispositifs expérimentaux. Dans le cas de la diffusion des neutrons, les appareils sont t ès demandés de sorte que le temps alloué à la Biologie est toujours insuffisant. C’est pourquoi, nous projetons d’implanter, au laboratoire, un nouveau spectromètre, à temps de vol, du même type que l’instrument IN6 de l’ILL; ce spectromètre, à cause de sa moins bonne résolution en énergie, permettrait d’atteindre des temps plus courts que l’appareil Mibémol ce qui est important pour l’étude détaillée de la dynamique des protéines, à différentes échelles de temps. De plus, dans cette optique, en collaboration avec l’Institut de Biologie Structurale de Grenoble, nous avons fait une demande auprès de nos organismes de tutelle pour la mise en CRG (Collaborative Reseach Group) de l’instrument IN13 qui permet de sonder la dynamique dans un domaine spatio-temporel unique où temps relativement courts et longues distances sont associés.

D’autre part, comme il se doit, toutes ces études sont couplées à celles de la structure et de la dynamique de l’eau interfaciale qui fait l’objet de posters dans le chapitre ‘Systèmes désordonnés, liquides et amorphes’ de ce rapport.

Comme nous l’avons mentionné ci-dessus, les thématiques que nous développons nécessitent des informations issues de méthodes variées.

La diffusion des rayons X aux petits angles est déjà utilisée, en complément de la diffusion des neutrons. Cependant, nous souhaitons nous orienter vers des études structurales résolues dans le temps, (gamme de la milliseconde à la picoseconde) qui sont rendues possibles grâce au flux élevé du rayonnement synchrotron, à condition bien sûr de s’affranchir de l’endommagement de l’échantillon.

En ce qui concerne l’étude des excitations collectives dans les protéines, déjà mises en évidence par diffusion inélastique de neutrons, sur un spectromètre à 3 axes thermiques (résolution voisine de 3 meV), nous allons continuer à exploiter la possibilité toute récente de la diffusion inélastique cohérente des rayons X. En effet, par rapport aux neutrons, cette technique permet d’accéder à une gamme plus vaste de transfert de moments et de bénéficier d’une meilleure résolution en énergie (2 meV).

Les collaborations et les échanges se sont révélés très fructueux avec les laboratoires de biologie, ce qui a été facilité par le Groupement de Recherche du CNRS intitulé : Modélisation des Assemblages Moléculaires Complexes.

Dans le cadre de ce GDR, un colloque ayant pour thème : Structure et Dynamique de l’Eau Interfaciale a été organisé à Saclay, les 29, 30, 31 mai 1996, et a rencontré un vif succès, en rassemblant un public interdisciplinaire d’environ 200 participants. La demande pour la création d’un nouveau GDR, issu du précédent, et dont la thématique est centrée sur la relation dynamique-fonction des macromolécules biologiques est en cours auprès des trois directions scientifiques concernées du CNRS (Sciences de la Vie, Sciences Physiques et Mathématiques, Sciences Chimiques). De plus, une école thématique sur ‘les Processus d’Hydratation en Biologie’ est prévue du 4 au 15 mai 1998, au Centre de Physique Théorique des Houches.