L'analyse glycomique consiste à établir le profil des oligosaccharides présents dans un fluide biologique d’intérêt, qu’ils soient présents à l’état libre ou liés aux protéines. Néanmoins, les matériaux utilisés dans les protocoles de préparation des échantillons imposent de nombreuses étapes manuelles, chronophages et pas toujours compatibles avec une analyse à haut débit des échantillons. A l’inverse, les Monolithes à Porosité Hiérarchisée (HPMs), préparés par la méthode sol-gel accompagnée d’une séparation de phase, présentent de remarquables propriétés microstructurales et texturales, ce qui les rend particulièrement adaptés à l'extraction et à l'enrichissement d’analytes d'intérêt. Pourtant, de tels matériaux n’ont jamais été utilisés pour l’analyse glycomique.
Dans ce contexte, nous nous sommes intéressés (i) au développement d’un HPM de silice pure basé sur une porosité bimodale finement contrôlée, (ii) à son utilisation en tant qu’outil innovant pour la préparation d'échantillons lors de l'analyse glycomique, et enfin (iii) à l’implémentation d’une nouvelle méthode pour moduler et miniaturiser sa mise en forme.
Le procédé de synthèse des HPMs, développé dans ce travail, a démontré sa robustesse pour générer une modulation précise de la porosité bimodale ([0.1-5] µm et [1-30] nm). En plus des mesures des propriétés microstructurales et texturales (MEB, porosimétrie Hg, etc.), des analyses chimiques (XPS, ATR-FTIR) ont été réalisées et des outils de caractérisation avancée de la porosité pour les HPMs ont été mis en place donnant accès aux propriétés de la microstructure (morphologie, porosité fermée, taille des micro- et méso- pores). En outre, une première évaluation du transport de petites molécules à travers le réseau mésoporeux a été réalisée par tomographie TEM. Le matériau a été produit sous différentes formes (colonnes monolithiques autoportées et en capillaires) et tailles (I.D : 0.05 – 5 mm), et intégrés à des dispositifs fluidiques miniaturisés. Son application pour l'analyse des oligosaccharides libres et liés aux protéines présents dans des échantillons de biofluides humains (plasma et lait) et de leur détection par spectrométrie de masse MALDI-TOF a alors été évalué en tant que preuve de concept. Enfin, l’optimisation des protocoles en lien avec des caractérisations poussées du matériau, a permis d’étudier les mécanismes d’interaction entre les oligosaccharides et la silice d’un point de vue chimique et stérique.
Finalement, la mise au point des HPMs, des protocoles et des dispositifs ont permis, d’une part, d’utiliser des volumes d’échantillons et de solvants 800 fois plus faibles que ceux utilisés traditionnellement, et d’autre part, de procéder à une purification simple, rapide et efficace, surpassant les protocoles courants dans les laboratoires.
Mots-clés : Analyse glycomique, sol-gel, silice, caractérisation porosité, miniaturisation.
Innovative porous materials for enhanced glycomic analysis
Abstract:
The glycomic analysis consists in establishing the profile of oligosaccharides enzymatically released from all the glycoproteins present in a biological fluid of interest, whether they are present in the free form or bound to proteins. However, sample preparation involves many steps that are often manual, time-consuming and not directly compatible with the high-throughput analysis of the samples. Hierarchical porosity sol-gel monoliths (HPMs) have outstanding microstructural and textural properties (high porosity and specific surface area) makes them ideally suited for the extraction and enrichment of analytes of interest in various analytical approaches. However, pure inorganic materials have rarely been considered in glycomics field.
In this context, we report on: (i) a pure silica HPM based on a finely tuned bimodal porosity thoroughly controlled, (ii) its use as an innovative tool for sample preparation prior to glycan analysis by mass spectrometry in a glycomics context (iii) and a relevant experimental protocol for efficient downsizing and its miniaturization.
The monolith synthesis has been studied in detail with a special emphasize on its robustness and on the modulations of the bimodal porosity obtained ([0.1–5] µm and [1-30] nm). Beside microstructural and textural properties studies (SEM, Hg porosimetry, etc.), chemical analyses (XPS, ATR-FTIR) have also been performed and new tools for the characterization of the porosity for such a particular type of materials, have been implemented giving access to the properties of the microstructure (morphology, closed porosity, size of micro- and meso-pores, etc.). Furthermore, TEM tomography has been used to evaluate the transport of small molecules through the mesoporous network. Finally, the material was produced in different shapes and sizes (50 µm – 5 mm in diameter) demonstrating a high flexibility of the approach to generate devices dedicated to a biological analysis. The use of HPM for the analysis of both free and protein-bound oligosaccharides present in relevant biological samples (human blood and milk) and their detection by MALDI-TOF mass spectrometry has been performed. After thorough optimization of the experimental conditions and the precise characterization of the material, the interaction mechanisms between oligosaccharides and silica have been investigated further.
Optimizations in the HPMs fabrication process as well as of the protocols, allowed, on the one hand, to use sample and solvent volumes 800 times smaller than those traditionally used, and on the other hand, enabled straightforward, effective and time-efficient purification, thus outperforming common laboratory glycomics protocols.
Keywords: Glycomic analysis, sol-gel, , miniaturization, silica, porosity characterization.
