Le système du complément est une composante essentielle de l'immunité innée permettant l’opsonisaton et l'élimination des agents pathogènes. Le système du complément est activé selon trois voies - voie classique, voie alterne et celle des lectines- qui toutes convergent vers la protéine centrale C3 (187 kDa). L’activation de C3 par clivage protéolytique par l’enzyme C3-convertase conduit à deux fragments peptidiques C3a (9 kDa) et C3b (177 kDa) interagissant avec différents récepteurs cellulaires (CR1, CR3, CR4) et des facteurs de régulation du complément (facteurs H et B). De nombreux processus pathologiques sont liés à des dysfonctionnements du complément (maladies auto-immunes, pathologies inflammatoires). Connaître la structure détaillée de C3, C3b et de leurs régulateurs est donc primordial pour le développement de molécules à visée thérapeutique.
Des études structurales de C3 et C3b ont déjà été décrites par microscopie électronique, cristallographie ou échange hydrogène-deutérium. Cependant, ces méthodes ne sont pas adaptées pour sonder la dynamique conformationnelle essentielle à la fonction de C3.
Notre objectif est d’explorer la dynamique conformationnelle de C3 par une nouvelle approche reposant sur le marquage protéique à l’échelle de la milliseconde par les radicaux hydroxyle et l'analyse par spectrométrie de masse (MS). Ces radicaux sont produits par photolyse de molécules d’eau à partir d’une source lumineuse à haut flux. C’est dans ce contexte que nous avons évalué deux sources, celle issue de l'accélérateur linéaire (Linac) ALIENOR et celle (Metrology) du synchrotron SOLEIL. Les radicaux hydroxyle réagissent avec des sites réactifs accessibles au solvant des chaînes latérales des acides aminés. Les protéines irradiées sont ensuite protéolysées, et les peptides formés sont analysés par nanoLC-MSMS. L’identification des peptides modifiés et l’évaluation par spectrométrie de masse quantitative de la variation de ce marquage au cours d’un processus réactionnel permettent de déterminer les sites protéiques impliqués dans un réarrangement conformationnel et/ou intervenant dans la formation de complexes.
Les avantages du marquage résolu en temps par les radicaux hydroxyle sont la capacité à sonder finement l’accessibilité au solvant, sur des durées compatibles avec le suivi de réarrangements conformationnels ou d’association non-covalente, et sans limitation de taille des molécules étudiées.
