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Analyse LC-HRMS/MS et RMN d’urines de souris marquées au C-13. Elucidation structurale de métabolites inconnus
LC-HRMS/MS and NMR analysis of C-13 labeled mouse urine. Structural elucidation of unknown metabolites

Spécialité

Chimie analytique

Niveau d'étude

Bac+5

Formation

Master 2

Unité d'accueil

Candidature avant le

31/01/2021

Durée

6 mois

Poursuite possible en thèse

oui

Contact

HUBER Gaspard
+33 1 69 08 64 82

Résumé/Summary
La spectrométrie de masse à haute résolution (HRMS) et la résonance magnétique nucléaire (RMN) sont deux techniques complémentaires pour l'analyse de mélanges complexes en solution comme le métabolome. L'opportunité d'analyser, par ces deux techniques, des échantillons d'urine marquée au C-13, en complément d'autres échantillons non marqués obtenus dans des conditions similaires, doit permettre au cours de ce stage de gros progrès dans l'élucidation structurale de composés inconnus.
High resolution mass spectrometry (HRMS) and nuclear magnetic resonance (NMR) are two complementary techniques for the analysis of complex mixtures in solution such as the metabolome. During this trainee-ship, the opportunity to analyze, by these two techniques, urine samples labeled with C-13, in addition to other unlabeled samples obtained under similar conditions, should allow great progress in the structural elucidation of unknown compounds.
Sujet détaillé/Full description
Contexte et projet de recherche du M2

La métabolomique vise à caractériser l'ensemble des "petites molécules" (< 1500 Da) d'un échantillon biologique et repose principalement sur deux techniques analytiques : la spectrométrie de masse à haute résolution (HRMS) et la résonance magnétique nucléaire (RMN).[1,2] Malgré la très forte complémentarité de ces deux approches, elles sont encore très rarement utilisées de concert pour l’annotation du métabolome. Alors que l’analyse LC-HRMS d’un unique échantillon biologique complexe permet la détection de milliers de signaux à des concentrations allant jusqu’au nanomolaire, la RMN permet l’identification structurale des métabolites les plus abondants de cet échantillon. Cette dernière technique souffre cependant d’un manque de sensibilité, c’est pourquoi l’accès à un « matériel biologique » entièrement marqué au C-13 (isotope stable du C-12) est une opportunité permettant : (1) d'augmenter la résolution spectrale et ainsi augmenter le nombre de métabolites caractérisables par RMN, et (2) de faciliter l’attribution des compositions élémentaires des signaux HRMS issus de métabolites inconnus par comparaison des profils LC-HRMS d’échantillons marqués et non marqués récoltés dans les mêmes conditions.
Le projet de recherche de M2 vise à analyser, par spectrométrie de masse à très haute résolution (Orbitrap Fusion, Thermo) couplée à la chromatographie liquide et par RMN 2D hétéronucléaire, les urines de souris marquées au carbone-13 et de les comparer aux urines non marquées. Cette étude visera à exploiter de façon synergique les données obtenues via les deux techniques analytiques pour identifier les métabolites inconnus détectés dans les échantillons. L’élucidation structurale des composés sera également appuyée par des acquisitions LC-HRMS/MS.

Environnement de travail

Le stage M2 se déroulera au sein de deux laboratoires du CEA de Saclay : (1) le laboratoire d’étude du métabolisme des médicaments (LEMM), institut Joliot ; et (2) le laboratoire Structure et Dynamique par résonance magnétique (LSDRM), IRAMIS.
Le LEMM s’est spécialisé dans l’analyse métabolomique depuis 2002, accumulant ainsi une expertise en terme de développement et de validation de méthodes LC-MS pour le profilage de biofluides et extraits tissulaires et cellulaires. Il est équipé d’une plateforme analytique constituée de 6 instruments à basse résolution (QqQ) et 7 instruments à haute et très haute résolution (Orbitrap et Q-TOF).
Le LSDRM est expert en développement d’approches originales pour la spectroscopie de résonance magnétique. Il est équipé de 6 spectromètres RMN de 1.0 à 11.7 T.

Profil du candidat et candidature

Etudiant ingénieur et/ou M2 en chimie. Spécialité chimie analytique ou chimie organique avec un intérêt pour la chimie analytique et plus particulièrement la spectrométrie de masse et la RMN. Date de début souhaitée: février 2021.
Les candidatures (CV et lettre de motivation) sont à envoyer à annelaure.damont@cea.fr et gaspard.huber@cea.fr

[1] Theodoridis G A et al. Liquid chromatography–mass spectrometry based global metabolite profiling: A review. Analytica Chimica Acta 2012, 711, 7-16.
[2] Nagana Gowda G A et al. Recent Advances in NMR-Based Metabolomics. Anal. Chem., 2017, 89 (1), 490-510.
Context and M2 research project

Metabolomics aims to characterize all the "small molecules" (<1500 Da) of a biological sample and is based mainly on two analytical techniques: high resolution mass spectrometry (HRMS) and nuclear magnetic resonance (NMR). [1,2] Despite the high complementarity of these two approaches, they are still very rarely used together for the annotation of the metabolome. While LC-HRMS analysis of a single complex biological sample can detect thousands of signals at concentrations down to nanomolar, NMR allows structural identification of the most abundant metabolites in that sample. However, this last technique suffers from a lack of sensitivity. Thus, the access to "biological material" fully labeled with C-13 (stable isotope of C-12) is an opportunity allowing: (1) to increase spectral resolution and thus increase the number of metabolites that can be characterized by NMR, and (2) facilitate the assignment of elementary compositions of HRMS signals from unknown metabolites by comparison of LC-HRMS profiles of labeled and unlabeled samples collected in the same conditions.
The M2 research project aims to analyze, by very high resolution mass spectrometry (Orbitrap Fusion, Thermo) coupled with liquid chromatography and by heteronuclear 2D NMR, the urine of mice labeled with carbon-13 and to compare them with unlabeled urine. This study will aim to synergistically exploit the data obtained via both analytical techniques to identify some unknown metabolites detected in the samples. The structural elucidation of the compounds will also be supported by LC-HRMS / MS acquisitions.

Working environment

The M2 traineeship will take place in two CEA Saclay laboratories: (1) the drug metabolism study laboratory (LEMM), Joliot institute; and (2) the laboratoire structure et dynamique par résonance magnétique (LSDRM), IRAMIS.
LEMM is specialized in the analysis of the metabolome since 2002, thus accumulating expertise in the development and validation of LC-MS methods for profiling biofluids, and tissue and cell extracts. It is equipped with an analytical platform consisting of 6 low resolution instruments (QqQ) and 7 high and very high resolution instruments (Orbitrap and Q-TOF).
LSDRM is an expert in developing novel approaches for magnetic resonance spectroscopy. It is equipped with 6 NMR spectrometers from 1.0 to 11.7 T.

Profile of the candidate and application

Engineering student and/or M2 in chemistry. Specialty in analytical chemistry or organic chemistry with an interest in analytical chemistry and more particularly mass spectrometry and NMR. Desired start date: February 2021.
Applications (CV and cover letter) should be sent to annelaure.damont@cea.fr and gaspard.huber@cea.fr

[1] Theodoridis G A et al. Liquid chromatography–mass spectrometry based global metabolite profiling: A review. Analytica Chimica Acta 2012, 711, 7-16.
[2] Nagana Gowda G A et al. Recent Advances in NMR-Based Metabolomics. Anal. Chem., 2017, 89 (1), 490-510.
Mots clés/Keywords
metabolomique
metabolomics
Compétences/Skills
spectrométrie de masse, résonance magnétique nucléaire
mass spectrometry, nuclear magnetic resonance
Logiciels
XCalibur Topspin
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Mise au point de l'analyse de mélanges complexes par RMN au moyen du parahydrogène

Spécialité

Spectroscopie

Niveau d'étude

Bac+5

Formation

Master 2

Unité d'accueil

Candidature avant le

31/01/2021

Durée

6 mois

Poursuite possible en thèse

oui

Contact

HUBER Gaspard
+33 1 69 08 64 82

Résumé/Summary
La Résonance Magnétique Nucléaire (RMN), malgré sa faible sensibilité, offre des atouts certains dans l'analyse des extraits métaboliques. L'objet de ce stage est d'appliquer à ces mélanges complexes une technique récemment découverte qui vise à augmenter drastiquement la sensibilité de la RMN.
NMR, despite its low sensitivity, is an analytical technique with definite advantages in the analysis of metabolic extracts. The object of this traineeship is to apply to these complex mixtures a recently discovered technique which aims to drastically increase the sensitivity of NMR.
Sujet détaillé/Full description
La métabolomique vise à caractériser l'ensemble des "petites molécules" (< 1500 Da) d'un échantillon biologique et repose principalement sur la spectrométrie de masse à haute résolution (HRMS) et la résonance magnétique nucléaire (RMN). L’analyse LC-HRMS d’un unique échantillon biologique complexe permet la détection de milliers de signaux à des concentrations allant jusqu’au nanomolaire, alors que la RMN permet l’identification structurale de métabolites, mais seulement des plus abondants en raison de son manque de sensibilité. Une des méthodes connues pour augmenter drastiquement la sensibilité de la RMN emploie les propriétés particulières du parahydrogène. Le laboratoire a développé un montage d'enrichissement du dihydrogène en parahydrogène et effectué des développements méthodologiques sur son utilisation par RMN [1]. Récemment la gamme des molécules dont les signaux RMN sont sensibles à la méthode, jusque-là assez restreinte, a été étendue aux molécules possédant au moins un proton échangeable, une méthode nommée SABRE-Relay [2]. L'observation de noyaux C-13, compatible avec cette récente méthode, permet d'augmenter la résolution spectrale. L’accès à un « matériel biologique » entièrement marqué au C-13 est une opportunité permettant d'observer les noyaux C-13 par SABRE-Relay, et ainsi d'augmenter drastiquement la résolution spectrale par rapport à un spectre RMN du proton. Le laboratoire partenaire LEMM possède actuellement des échantillons d’urines de souris « marquées » au C-13 (et leurs équivalents non marqués) issus de rongeurs ayant été alimentés avec des nutriments intégralement marqués au C-13.
Le projet de recherche de M2 vise à mettre au point au laboratoire la méthode SABRE-Relay et à l'optimiser lors de son application à un jeu d'échantillons d'extraits métaboliques enrichis en isotope 13C. Cet enrichissement isotopique permet d'imaginer de nouvelles expériences de RMN pour mieux caractériser certains métabolites. Les résultats seront ensuite comparés à ceux obtenus par ailleurs par HRMS sur les mêmes échantillons.
Le stage M2 se déroulera au laboratoire structure et dynamique par résonance magnétique (LSDRM)du CEA de Saclay, en collaboration avec le laboratoire d’étude du métabolisme des médicaments (LEMM), dans le cadre d'une étude plus large conjuguant des analyses métabolomiques à base de RMN et de HRMS.
Le LSDRM est expert en développement d’approches originales pour la spectroscopie de résonance magnétique. Il développe en particulier des méthodes visant à augmenter la sensibilité de la RMN. Il est équipé de 6 spectromètres RMN de 1.0 à 11.7 T. Le LEMM s’est spécialisé dans l’analyse métabolomique depuis 2002, accumulant ainsi une expertise en terme de développement et de validation de méthodes LC-MS pour le profilage de biofluides et d'extraits tissulaires et cellulaires.
Profil du candidat
Etudiant ingénieur et/ou M2 en physico-chimie ou chimie. Spécialité chimie analytique ou physico-chimie avec un intérêt pour la RMN, l'instrumentation et les sciences expérimentales.

[1] Guduff et al. Single-Scan Diffusion-Ordered NMR Spectroscopy of SABRE-Hyperpolarized Mixtures. ChemPhysChem 2019, 20, 392–398.
[2] Iali et al. Using parahydrogen to hyperpolarize amines, amides, carboxylic acids, alcohols, phosphates, and carbonates. Sci. Adv. 2018; 4 : eaao6250
Metabolomics aims to characterize all the "small molecules" (less than 1500 Da) of a biological sample and is based mainly on high resolution mass spectrometry (HRMS) and nuclear magnetic resonance (NMR). LC-HRMS analysis of a single complex biological sample allows the detection of thousands of signals at concentrations down to nanomolar, while NMR allows structural identification of metabolites, but only the most abundant due to the lack of sensitivity of NMR. One of the known methods to drastically increase the sensitivity of NMR employs the particular properties of parahydrogen. The laboratory has developed an assembly for enriching dihydrogen in parahydrogen and carried out methodological developments on its use by NMR [1]. Recently the range of molecules whose NMR signals are sensitive to the method has been extended to molecules possessing at least one exchangeable proton, a method called SABRE-Relay [2]. The observation of C-13 nuclei, compatible with this recent method, makes it possible to increase the spectral resolution. Access to "biological material" fully labeled with C-13 is an opportunity to observe C-13 nuclei by SABRE-Relay, and thus to drastically increase the spectral resolution compared to a proton NMR spectrum. LSDRM starts a collaboration with LEMM which owns urine samples from mice labeled with C-13 (and their unlabeled, C-12, equivalents) from rodents that have been fed with nutrients fully labeled with C-13.
The M2 research project aims to develop the SABRE-Relay method in the laboratory and to optimize it during its application to a set of samples of metabolic extracts enriched in the isotope 13C. This isotopic enrichment makes it possible to imagine new NMR experiments to better characterize some metabolites. The results will then be compared with those obtained by others at LEMM by HRMS on the same samples.
The M2 internship will take place in the laboratoire structure et dynamique par résonance magnétique (LSDRM) of the CEA, at Saclay, in collaboration with the laboratory for the study of drug metabolism (laboratoire d’étude du métabolisme des médicaments, LEMM) taking part of a larger study combining metabolomic analyzes based on NMR and HRMS.
LSDRM is an expert in developing novel approaches to magnetic resonance spectroscopy, in particular in the field of methods aiming at increasing the sensitivity of NMR. LSDRM is equipped with 6 NMR spectrometers from 1.0 to 11.7 T. LEMM is specialized in metabolomic analysis since 2002. LEMM has accumulated expertise in the development and validation of LC-MS methods for profiling tissue and cell extracts, and biofluids.

Profile of the candidate
Engineer and/or M2 student in physico-chemistry or chemistry. Specialty in analytical chemistry or physico-chemistry with an interest in NMR, instrumentation and experimental sciences.

[1] Guduff et al. Single-Scan Diffusion-Ordered NMR Spectroscopy of SABRE-Hyperpolarized Mixtures. ChemPhysChem 2019, 20, 392–398.
[2] Iali et al. Using parahydrogen to hyperpolarize amines, amides, carboxylic acids, alcohols, phosphates, and carbonates. Sci. Adv. 2018; 4 : eaao6250
Mots clés/Keywords
Instrumentation, Hyperpolarisation, Manipulation de gaz
Instrumentation, Hyperpolarization, Gas handling
Compétences/Skills
Résonance Magnétique Nucléaire
Nuclear Magnetic Resonance
Logiciels
Topspin

 

 

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